原始项目文章mssystems | 多组分析：人工窖泥培养技术和白酒质量

前言

浓香型白酒（SFB）在窖泥窖发酵过程中获得了独特的风味。 窖泥中的微生物是产生风味酯的关键前体。 四川省农业科学院水稻高粱研究所（第一工作：刘茂科）在微生物学专刊“ mssystems”（如果= 6.519）中发表了题为“中国白酒期间艺术性坑泥中原核生物群落的结构功能变化”的文章。 2020年3月，《生产》是结合宏观基因组学，宏观蛋白质组学和代谢组学对啤酒酿造微生态系统进行分析的第一项研究。多组分方法的应用可以更全面地了解生产过程中微生物群落的代谢过程变化

标题：在生产过程中，人工窖泥中的原核生物群落的结构和功能的变化将有助于进一步优化人工窖泥的培养技术，提高of州市风味酒的质量。 浓香型白酒

研究对象：浓香型白酒，人工窖泥

期刊： mssystes

影响因子：6.519

出版时间：2020年3月

合作单位：四川省农业科学院水稻高粱研究所

使用Ouyi / Luming生物技术：TMT标记定量蛋白质组学，PRM靶向验证，非靶向GC-MS代谢组学 ，LC-MS代谢组学

的研究背景

通过白酒的固态发酵进行发酵Lu州风味酒是世界上最古老的馏出物之一，年产量为910万吨。 zhou州风味酒含有己酸乙酯，丁酸乙酯，乳酸乙酯，乙酸乙酯和其他风味酯。 根据己酸乙酯的含量，Lu州风味酒的质量可分为不同等级。 通过增加己酸乙酯和乳酸乙酯的比例可以提高Lu州风味酒的质量。 高粱是Lu州风味酒发酵的主要谷物，其中涉及多种源自泥浆的微生物和一种称为大曲的糖化剂。

矿坑泥浆中的微生物可产生多种小的有机酸（如己酸，丁酸，乙酸和乳酸），它们是风味酯的关键前体，这在很大程度上决定了zhou州风味酒的质量。 由于成熟泥中特殊的微生物群落，因此只能使用成熟泥来酿造高品质的浓香型白酒。 但是，浆液的自然成熟期超过20年，严重限制了优质Lu州风味酒的生产。 自1960年代以来，基于对天然矿渣泥微生物学的了解，人们开始生产人工矿渣泥，以改善高品质zhou州风味酒的生产。

通常是通过将发酵剂接种到新鲜土壤，天然成熟泥，小麦和豆粕的混合物中，然后在厌氧条件下孵育30至60天来制备人工窖泥。 目前，有很多栽培方法和分子方法来研究人工泥浆中的微生物群落。 但是，我们对人工泥浆中微生物动力学和相关功能变化的分子机制以及这种变化在生产优质Lu州风味酒中的作用的了解仍然有限。

研究流程

结果显示为

1。 人工窖泥的理化性质

作者从Lu州风味酒酿造的初始状态和前四个酿造批次的末期抽取了人工窖泥，每批的酿造时间为90天。 根据理化性质的分析，在人工矿坑泥的成熟过程中，样品的腐殖质和有效磷含量分别增加了41.84％和200.00％（P <0.05）（表1）。 随着时间的流逝，水，有机物，pH，总氮，总磷，总钾，NH4 +和有效钾的含量保持相似。 表2 Lu州风味酒酿造过程中人工窖泥样品的理化特性和原核生物群落特征

2 Lu州风味酒样品中总共检测到31种风味化合物：12种酯，8种醇，6种酸，3种醛和2种酮。 主要调味剂化合物包括己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯，丁酸乙酯，1-丙醇，3-甲基丁醇，正己醇，2-丁醇，乙酸，丁酸，己酸，异戊酸和乙二醛。 这13种风味物质占样品中总风味物质的95.73％（图1a）。 己酸乙酯和丁酸乙酯的含量增加（P ＜0.05），并分别在第四批和第三批中达到最高水平。 从第一批到第二批，乙酸乙酯的含量显着下降（P <0.05）（图1b）。 己酸乙酯与乳酸乙酯的比例从0.81稳定增加到2.77（P ＜0.05），表明Lu州风味酒的质量得到了改善（图1c）。

图1 zhou州风味酒酿造过程中风味化合物的动力学

（a）Lu州风味酒样品中风味化合物浓度的热分析图，红色是主要化合物。 （b）Lu州风味酒样品中己酸乙酯，乙酸乙酯，乳酸乙酯和丁酸乙酯的浓度。 （c）己酸乙酯与乳酸乙酯的比例。 B.第一批； C，第二批； D，第三批； E，第四批。 在

3.16s rRNA基因的扩增序列和qpcr

的主成分分析（PCA）中，原核生物群落显示出批次依赖性聚类（图2a）。 OTU分为36个原核生物类别。 在至少一种人造矿坑泥的成熟阶段，最丰富的九类是芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌，大肠菌，放线菌，阴性菌，γ-变形杆菌，α变形杆菌，细菌和增效作用（图2b）。 通过qPCR定量最丰富的OTU（梭菌和乳杆菌）。 梭状芽孢杆菌的浓度在第一批中显着下降，然后逐渐增加。 乳酸菌浓度在第一批中升高，然后在第二批中降低（图2C）。

图2.通过坑坑中原核生物的16S rRNA基因分析对

（a）OTU进行主成分分析。 （b）最丰富的原核生物种类的比例。 （c）梭菌和乳杆菌的16S RNA基因拷贝的平均数。 （d）预测与糖和有机酸代谢有关的KEGG同源物的丰度。 A.初期阶段； B，第一批； C，第二批； D，第三批； E，第四批。

4。 Lu州风味酒的原核生物群落与理化性质和主要风味物质的关系

皮尔逊人工坑泥与最丰富的原核生物的理化性质之间的相关性分析表明，总氮，有效磷和有效钾与15个属有关（ 图3a）。 在15个属中，有6个属与Lu州风味酒样品中的8种以上主要风味化合物有关（图3b）。

图3主要原核生物与理化性质之间的Pearson相关系数

（a）人工窖泥（b）zhou州风味酒样品的风味成分。

5。 人工坑泥

的原核生物群落的蛋白质组学分析。 接下来，为了更好地了解Lu州风味酒的功能变化及其与质量的关系，作者分析了第一批和第四批人工窖泥样品的蛋白质组学和代谢组学。 通过TMT蛋白质组学共鉴定出213种原核蛋白。 三个最丰富的类别占原核蛋白的78.39％（图4A）。 Negativites（32.39％）是最丰富的类别，其次是梭菌（23.00％）和杆菌（23.00％）。 鉴定出的蛋白质来自70属，包括乳杆菌，梭状芽胞杆菌和孢子菌（18.31％，9.86％和5.16％）。 鉴定出来自24个属的47种差异蛋白，主要是乳酸杆菌（图4C）。 对差异蛋白质进行的分析发现，最大的变化发生在代谢过程中，包括ADP代谢，嘌呤核糖核苷二磷酸代谢和嘌呤核糖核苷二磷酸代谢（图4D）。

图4 | 第一批和第四批人工坑泥样品

中原核生物群落的元蛋白质组分析（a）基于分类的原核生物分类。 （b）基于属的原核生物分类。 （c）差异蛋白。 （d）富集差异蛋白。

6。 人工坑泥的代谢组学分析

非目标代谢组学分析确定了7478种代谢产物。 GC-MS代谢组学和LC-MS代谢组学可以清楚地将opls-da中的批次分开（图5a-d）。 在第四批人工矿井泥样品中，分别有491种和523种代谢产物上调和下调。 差异代谢产物分为16个功能组（图5F）。 脂质和类脂质分子最多（38.07％），其次是杂环化合物（16.17％）和有机酸及其衍生物（13.11％）。

图5 |

为第一批和第四批人工矿渣样品的代谢组学分析提供了散布图（A和b）和相应的交叉验证图（C和D）。 其中（A和C）来自GC-MS，（B和D）来自LC-MS。 差异代谢物的强度水平（E）和官能团（f）。 （g）己酸，丁酸和乳酸的平均水平。

7。 Lu州风味液中决定香精酯的关键物质的合成代谢途径

Lu州风味液中决定香精酯的关键物质的合成p4人工坑泥样品中己酸的含量高于 在第一批人工矿坑泥浆样品中（P ＜0.05），而丁酸和乳酸的含量较低（P ＜0.05）（图5g）。 基于KEGG富集的分析，确定了己酸，丁酸和乳酸的代谢途径（图6）。 在许多方面，丁酸代谢和丙酮酸代谢直接参与己酸，丁酸和乳酸的生产。

图6人造坑泥中己酸，丁酸和乳酸的合成途径，蛋白质，代谢产物和物质的示意图

实验结论

这项多层组织化学研究确定了分类基团的特定功能和代谢途径在 人工泥浆成熟的过程。 结果揭示了原核生物群落中的几个成员与人工坑泥中代谢产物和蛋白质之间的关键关系。 这些候选微生物，蛋白质和代谢产物可能是预测人工窖泥质量和发酵状态的指标，这将有助于进一步优化人工窖泥的培养技术，提高Lu州风味酒的质量。

小鹿建议

zhou州风味酒占中国白酒总产量的70％以上。 自1960年代以来，在中国白酒酿造行业中，人工窖泥已广泛用于建造发酵窖，以生产高品质的浓香型白酒。 为了进一步了解人工窖泥的原核生物分类和功能动力学机制，以及这种变化与优质Lu州风味酒的生产之间的关系，该研究首先进行了宏观基因组学，宏观蛋白质组学和代谢组学的联合分析。 酿造微生态。 该多组分方法可以更全面地了解优质zhou州风味酒生产过程中微生物群落的代谢过程，有助于进一步优化人工窖泥的培养工艺，提高Lu州风味酒的质量。 在

结束时，我们使用基因组学，蛋白质组学和代谢组学的多层次研究方法，并使用PRM目标验证技术来探索矿泥质量和发酵状态的目标。 鹿鸣生物学是中国早期的团队，主要进行基于蛋白质组学和代谢组学的多层次组织化学整合实验和分析。